Empresas / VERILAB S.A.<br>ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS POR PCR

Escherichia Coli productora de verotoxinas (STEC) es un importante patógeno humano cuya transmisión más frecuente ocurre a través de la ingesta de agua o alimentos contaminados. La infección con cepas de E. coli verotoxigénicas puede causar trastornos de tipo diarreico de intensidad variable, desde una diarrea autolimitada a cuadros de diarrea sanguinolenta que en algunos casos puede derivar en el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH). Teniendo en cuenta la gravedad del SUH, tanto en el período agudo como en la evolución de los pacientes, la gran cantidad de casos y la magnitud del impacto de éstos sobre el sistema de salud, es que esta enfermedad ha sido declarada de notificación obligatoria por el Ministerio de Salud Pública desde abril de 2000. La distribución estacional del SUH concentra los casos mayormente en los meses cálidos; además, se observa mayor frecuencia en las provincias del centro y sur del país. De acuerdo con los datos obtenidos por el Comité de Nefrología de la Sociedad Argentina de Pediatría, en nuestro país se producen alrededor de 300 casos nuevos de SUH por año. En 1999, la tasa de incidencia fue de 9.2 pacientes por cada 100.000 niños menores de 5 años, habiéndose acumulado más de 7.000 casos desde 1965 hasta el presente. El tracto intestinal del ganado vacuno es un reservorio de E. Coli (STEC). Por consiguiente los alimentos crudos de origen animal pueden estar contaminados por el microorganismo por contactar con materia fecal durante las operaciones de sacrificio y eviscerado. Actualmente se postula que el desarrollo de estos cuadros, más que la sola presencia de toxina, requiere la de bacterias vivas productoras de la misma conjuntamente con otros factores de virulencia, principalmente un factor de adherencia, que permite a la cepa que lo posee unirse al epitelio intestinal donde se reproduce, invade y sintetiza la toxina y otro factor de toxicidad denominado hemolisina. FACTORES DE RIESGO¿Cúal es el papel que cumplen los factores de virulencia de STEC en la patogenia del SUH?La bacteria tiene la capacidad de adherirse en forma íntima a las células intestinales del colon, provocando una extensa destrucción de las micro-vellosidades. Se observa que en esta lesión AE (attachment and effacement), la membrana epitelial envuelve a la bacteria formando una especie de pedestal. Después de la colonización, la bacteria se multiplica sintetizando y secretando la toxina Stx, la cual se une a su receptor específico Gb3 presente tanto en células del epitelio intestinal como en las vasculares. La toxina internalizada afecta la viabilidad celular por inhibición de la síntesis proteica. Además de provocar diarrea sanguinolenta o colitis hemorrágica, la toxina puede pasar al torrente sanguíneo y llegar a otros órganos blancos cuyas células endoteliales posean el receptor, poniéndose de manifiesto el daño característico de las enfermedades extraintestinales como el SUH. Se han caracterizado varios genes ligados a la patogenicidad de la E. coli: dos de ellos (stx1 y stx2) codifican para la toxina, en tanto que el gen eaeA codifica para el factor de adherencia y el gen hlyA codifica para la enterohemolisina A. Sin embargo, todavía no está claro el papel de cada uno de estos genes en la infección y cuales de ellos representan un riesgo potencial al encontrarlos en alimentos o agua. Aunque en algunos estudios epidemiológicos en los Estados Unidos de Norteamérica se ha observado que dos tercios de las infecciones en humanos producidas por cepas enterohemorrágicas de E. coli son causadas por el serotipo O157:H7 , en Australia el serotipo O111:NM es el agente causal más frecuente de esta enfermedad. Otros estudios, de Canadá, Europa, Argentina y Australia sugieren que la magnitud de la incidencia de infecciones por E coli No O157 es tanto o más importante que la de las causadas por E. coli O157 . Por consiguiente la búsqueda sólo de E. coli O157:H7 por cultivo e identificación serológica podría tener capacidad para detectar menos del 50% de las infecciones por E. coli verotoxigénica. Las cepas de E. coli causantes de estas enfermedades son difícilmente distinguibles de aquellas que integran la flora intestinal normal en el hombre y animales. Excepto para E. coli O 157:H7, no hay métodos de cultivo diferencial o selectivo para el diagnóstico de estas infecciones. Por lo tanto, el diagnóstico rápido se basa en la detección directa de las toxinas específicas o de los genes que las codifican. La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR-STX) permite detectar en forma rápida, sensible y específica la presencia de los genes que codifican para estas verotoxinas a partir de alimentos y distinguir si se trata de stx -1 (VT1) o stx-2 (VT2). Además, dada la necesidad de la presencia de factores de virulencia para el desarrollo de enfermedad, se realiza también la búsqueda de los genes eaeA y hlyA correspondientes al factor de adherencia y enterohemolisina A respectivamente.PROCEDIMIENTO DE PCR EN MUESTRAS DE ALIMENTOAl realizar la búsqueda de genes para verotoxinas en alimentos, se parte de una alícuota del mismo, se inocula en medios de enriquecimiento y se subcultiva en medios específicos. Partiendo del desarrollo obtenido en dichos medios se realiza el estudio por la técnica de PCR.Reacción en cadena de la Polimerasa

La PCR es utilizada para amplificar (copiar) secuencias de ADN específicas en una mezcla compleja, cuando se conocen los extremos de dicha secuencia.
La muestra de ADN original se desnaturaliza en hebras simples.
Dos oligonucleótidos sintéticos complementarios a los extremos 3’ del segmento de interés (iniciadores o primers ) se agregan en exceso al ADN desnaturalizado, y se hace que descienda la temperatura de la reacción.
El ADN permanece desnaturalizado, porque las hebras complementarias están a muy baja concentración para encontrarse durante el período de incubación, pero los primers hibridizan con sus secuencias complementarias en el ADN original.
Los oligos hibridizados sirven como iniciadores para la síntesis de ADN, que comienza con el agregado de nucleótidos y una polimerasa termo resistente (Taq polimerasa).
La Taq polimerasa extiende los iniciadores a temperaturas de 72ÞC produciendo la síntesis de nuevas hebras.
Cuando se completa la síntesis, la mezcla es calentada a 95ÞC para desnaturalizar las moléculas de ADN doble cadena recientemente formados.
Ciclos Repetidos (25—30) de desnaturalización, hibridación y síntesis amplifican el número de copias del ADN original. Si bien estos ensayos de PCR aún se encuentran en vías de validación por los entes oficiales, los datos obtenidos demuestran la utilidad de esta metodología para el control de calidad de alimentos susceptibles de contaminación con cepas bacterianas productoras de enterotoxinas de importancia sanitaria.

*Bioquímico, Magíster Scientiae en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Director Técnico de Verilab S.A.