Métodos de análisis, una evolución para garantizar la inocuidad de los alimentos

Los instrumentos de análisis microbiológico han pasado de las técnicas tradicionales a las cromatográficas, otorgando mayor sensibilidad y precisión en el control de productos cárnicos en todas sus etapas.

Por: Lic. Diego Rapela, Director del Laboratorio Dr. Rapela S.A y Secretario de CALIBA. Argentina

Fotos: Banco de imágenes

Las técnicas de análisis de alimentos siempre mantuvieron una estrecha relación con las regulaciones y reglamentaciones nacionales e internacionales, debido a que las normas establecidas para cada alimento no pueden regular más allá de lo que las técnicas analíticas del momento permitan monitorear. Por eso, a medida que la tecnología fue avanzando y los nuevos equipos permitían llegar a límites de detección cada vez más bajos, los máximos permitidos en las sustancias no deseadas fueron siendo cada vez menores y más exigentes.

La tecnología y los desarrollos analiticos también fueron evolucionando en búsqueda de más sensibilidad, tanto por una competencia comercial entre marcas, para lograr el equipo más sensible del mercado, como por parte de los investigadores para lograr metodologías que permitan detectar con más precisión y exactitud un contaminante que proteja más eficientemente a la población que consume ese alimento.

La presencia de microrganismos patógenos en un alimento es uno de los mayores causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAS). Los métodos de investigación o recuento microbiológicos mantienen como técnica de referencia a los llamados métodos tradicionales, que se basan en el cultivo bacteriano en placas de Petri o tubos con medios de cultivos selectivos. Estos métodos consisten en la siembra de una fracción del alimento en estudio homogeneizado en medios de cultivo con compuestos nutricionales específicos para la especie buscada. En algunos casos se utilizan medios cromogénicos. Estos medios tienen la particularidad de cambiar de color con las diferentes colonias, ya que los indicadores disueltos en éste reaccionan con los productos generados por una u otra colonia pudiendo diferenciar, de esta forma, más de un tipo de colonias en una misma placa.

Con el tiempo, la evolución en este tipo de técnicas se dio más que nada con los insumos utilizados, donde se fueron reemplazando las placas de vidrio reutilizables por placas descartables, pipetas descartables, ansa y una gran cantidad de elementos descartables junto a medios de cultivo comerciales listos para su uso. Todos estos elementos además de disminuir el riesgo de contaminación hacían más eficiente el proceso, pero no generaban modificaciones sustanciales en las técnicas de análisis.

Avances en los métodos de detección de microorganismos

En los últimos años fueron tomando mucha más fuerza las técnicas instrumentales de análisis microbiológico. Si bien estos equipos hace muchos años que existen, con lentitud fueron tomando su lugar en las bibliografías y legislaciones nacionales e internacionales como técnicas reconocidas para el análisis de ciertos patógenos. 

“La presencia de microrganismos patógenos en un alimento es uno de los mayores causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAS)”.

Hoy existen muchas marcas reconocidas que fabrican diferentes equipos para el control rápido de alimentos en el aspecto microbiológico. La gran mayoría se basan en la biología molecular, es decir en la búsqueda del ADN o ARN específico de una bacteria en particular. Para esto se realiza una etapa de preparación en la que se genera la ruptura bacteriana y liberación del material genético. Luego el equipo se encarga de la amplificación de una fracción característica del microrganismo buscado. Finalmente se realiza la identificación del mismo, si esta fracción genética se encuentra presente, el equipo concluye con que existe presencia del microorganismo en estudio. La ventaja es que no se requiere del tiempo de crecimiento de la bacteria como en los métodos tradicionales, lo que implica largos tiempos de incubación, tampoco el pasaje de un medio a otro para ir generando la aislación selectiva. Pero el principal beneficio es que son métodos altamente específicos y sensibles para la detección de microorganismos, lo cual es favorabble para el control de productos antes de su liberación de planta. Con los métodos tradicionales muchas veces se hacen controles post liberación de productos, lo que limita las acciones en caso de encontrar resultados positivos. 

En la industria cárnica esta metodología es utilizada para la detención de E.coli O157:H7, uno de los patógenos más peligroso para esta industria y por la alta especificidad de la técnica también se pueden determinar otros E.coli generadores de shiga toxina no O157, identificados como causantes de muchas intoxicaciones.

En el caso de los análisis de sustancias químicas no deseadas, es muy importante su control por las intoxicaciones que pueden causar de forma crónica como son los residuos de agroquímicos, metales pesados y otros componentes incorporados al músculo por medio de la dieta del animal antes de su faena. Otros grupos no deseados son los antibióticos aplicados a los animales que, si bien su consumo en bajas dosis no genera intoxicación al consumidor, el consumo sostenido de pequeñas cantidades termina generando resistencia a ese compuesto disminuyendo el efecto terapéutico de estos antibióticos en la población en general.

Cromatografía, un paso más hacia la precisión 

La necesidad de análisis cada vez más sensibles motiva el desarrollo de nuevas técnicas.  Las técnicas cromatográficas son las más utilizadas para el control de productos cárnicos en todas sus etapas. La cromatografía es un método de separación de compuestos diferentes dentro de unas muestras. Esta separación se basa en el pasaje de la muestra por una columna que tiene un relleno denominado fase estacionaria. Para forzar a la muestra a que pase por esta columna se bombea un solvente que se denomina fase móvil. Como los diferentes compuestos dentro de la muestra tienen más o menos afinidad a la fase estacionaria y a la fase móvil, los más afines a la fase estacionaria quedan más tiempo retenidos dentro de la columna hasta que la fase móvil logra sacarlos y, en el caso opuesto, los menos afines a la fase estacionaria son rápidamente liberados siendo los primeros en salir por la columna junto a la fase móvil que los empuja. Esto permite que los diferentes compuestos de una muestra, luego de someterse a una separación cromatográfica, queden separados e identificados según el orden de elución en ese sistema cromatográfico.

Para identificar los compuestos, se utilizan diferentes detectores que se colocan a la salida de la columna para ir reconociendo a los mismos a medida que van saliendo. Esta cromatografía se puede hacer en fase líquida (cromatografía líquida), donde la fase móvil corresponde a solventes líquidos; o en fase gaseosa donde la fase móvil es un gas y los compuestos buscados pueden ser gases o sustancias líquidas o sólidas con puntos de ebullición relativamente bajos que permiten, mediante el calentamiento de éstos, pasarlos a fase gaseosa y realizar esta separación de los compuestos en forma de gases (cromatografía gaseosa).

Según el tipo de cromatografía, se usan diferentes detectores. En el caso de cromatografía líquida los detectores más comunes son el de UV, donde se utiliza un espectrofotómetro UV a la salida de la columna para identificar los compuestos que tienen respuesta al UV. Una mejora de este detector es el DAD o arreglo de diodos que básicamente es un espectrofotómetro que permite medir todas las longitudes de onda en simultáneo permitiendo obtener espectros UV de todos los picos obtenidos.

También se utilizan detectores de FLD o fluorescencia para detectar compuestos con características fluorescentes o que generan fluorescencia con el agregado previo de algún reactivo. Como la presencia de fluorescencia es menos frecuente, éste es un detector que tiene un campo de análisis más limitado pero, al mismo tiempo, al ser más limitada la cantidad de compuestos presentes con fluorescencias hace que su identificación sea más específica y por ende más sensible; permitiendo obtener niveles de detección más bajos que los anteriores.

“Las técnicas cromatográficas son las más utilizadas para el control de productos cárnicos en todas sus etapas”

En el caso de la cromatografía en fase gaseosa, los detectores más comunes son el FID detector de ionización de llama, en el que todos los compuestos que salen de la columna son sometidos a una pequeña llama. Al ionizarse, generan una señal que es analizada por un detector de gran espectro y es utilizado para la determinación de un gran número de compuestos dentro de los que se pueden obtener los perfiles de ácidos grasos, la detección de ácidos grasos trans, algunos antibióticos y agroquímicos.

Otros detectores se basan en la identificación de elementos propios de la molécula a buscar, como por ejemplo NPD o detector de fósforo y nitrógeno, donde el detector es sensible solo a los compuestos que contienen estos minerales. Siendo detectores de muy alta sensibilidad y muy utilizados para la búsqueda de sustancias fosforadas como muchos plaguicidas.

Hoy en día los detectores que más desarrollo han tenido son los de espectrometría de masas. Este tipo de detector puede ser utilizado tanto en cromatografía gaseosa como líquida, siendo la líquida con detección por espectrometría de masas la de mayor espectro analítico actualmente. La ventaja de esta tecnología es la altísima especificidad obtenida en la detección de los compuestos buscados, combinada con una alta sensibilidad. Esto hace que sea aplicable a la búsqueda de trazas en matrices complejas como alimentos cárnicos. 

Esta detección se basa en la ruptura de las moléculas presentes en la muestra para luego ser detectados los iones generados de forma cuali-cuantitativa. El reporte generado por el equipo para el conjunto de iones de una molécula, luego de una ruptura molecular, se llama espectro de masas. Los equipos más sensibles generan una doble ruptura (LC-MS/MS). Es decir, la molécula original se rompe generando en su primera ruptura un espectro de iones padres que se vuelve a someter a ruptura, generando los iones llamados hijo. La relación entre unos y otros es llamada transición y estas transiciones son extremadamente específicas para cada molécula. 

Estas características asociadas de precisión y sensibilidad, sumado a que son detectores con muy pocas limitaciones en el rango de moléculas a detectar, los coloca dentro de los más elegidos en la búsqueda de residuos de plaguicidas, residuos de antibióticos, hormonas y trazas de diferentes sustancias en muy bajas concentraciones. Tal es así que en el caso de diferentes reglamentaciones nacionales como internacionales, se suele definir a este método como obligatorio para el análisis de ciertos parámetros por lo inequívoco de sus resultados. Un ejemplo de esto es el plan creha que menciona esta metodología como requerida para muchos de los parámetros establecidos para su control.

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